預期用途

定量檢測血清、血漿、細胞培養上清和組織等樣本中的小鼠骨骼肌肌鈣蛋白I (sTnI)濃度。

1、檢測原理

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。在預包被抗小鼠骨骼肌肌鈣蛋白I(sTnI)抗體(固相抗體)的微孔酶標板中，加入小鼠骨骼肌肌鈣蛋白I (sTnI)標準品和待測樣本，再加入另一株HRP標記的抗小鼠骨骼肌肌鈣蛋白I (sTnI)抗體(HRP標記抗體)，經過溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-HRP標記抗體的夾心復合物。加入顯色底物A和B，底物在HRP催化下，產生藍色產物，在終止液(2M硫酸)作用下，最終轉化為黃色。在酶標儀450nm波長上測定吸光度(OD值)，吸光度(OD值)與待測樣品中小鼠骨骼肌肌鈣蛋白I (sTnI)的濃度正相關。擬合標準品曲線，可以計算出樣本中小鼠骨骼肌肌鈣蛋白I (sTnI)的濃度。

2、試劑盒檢測的局限

1)僅供科研使用，不得用于臨床診斷

2)請在本試劑盒標示的有效期內使用。

3)試劑盒的試劑不能與其他批號的試劑或其他來源的試劑混合使用。

4)任何操作人員、移液技術、洗滌技術、孵育溫度、試劑盒保存時間的改變，都將影響結合反應。

5)本試劑盒在設計上去除或降低了生物學樣本中的一些內源性干擾因素，并非所有可能的影響因素都已經去除。

基本信息

1.試劑盒提供的材料

備注：

1)標準品濃度依次為：2000、1000、500、250、125、62.5 pg/mL。

2)經過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。

3)盒子拆封后必須在一個月內使用完；試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發和微生物的污染；相關試劑在分裝時會比標簽上標明的體積稍多一些，具體含量以實際收到的實物為主。

2、未提供的材料設備

1)能夠檢測450 nm吸光度的酶標儀

2)移液器及槍頭、加樣槽

3)37℃恒溫箱或水浴鍋

4)準備試劑用的試管、離心管、量筒等

5)蒸餾水或去離子水

6)渦旋振蕩器、微孔板振蕩器

3、貯存

試劑盒保存于2 - 8℃，有效期標注于標簽上(有效期一般是6個月)。只有恰當保存的試劑才是有保證的。如果試劑盒的組分需要再次使用，請確保上一次使用之后沒有被污染。

4、注意事項

1)所有的化學試劑理應被認為具有潛在危害。

2)推薦只有經過良好實驗室培訓的工作人員方可操作本試劑盒。操作時請佩戴合適的防護設施，例如白大衣、乳膠手套、安全眼鏡等。

3)請避免試劑接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

4)試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時，請佩戴防護服，及防護眼睛、手及面部的設施。

5)本試劑盒用于科學研究，不能用于診斷治療。

6)請不要使用過期的試劑。

7)在試劑盒的貯存或孵育過程請避免強光照射。

8)在操作試劑盒或處理樣本時請佩戴乳膠或一次性手套。

9)為了避免微生物的污染，以及試劑與樣本間的交叉污染，請使用一次性槍頭。

10)使用干凈的容器配制試劑。

11)試劑的準備必須使用蒸餾水或去離子水。

12)顯色底物在使用之前必須平衡至室溫。

13)液體廢棄物的處理。不含酸的液體廢棄物，加入1.0 %的次氯酸鈉，浸泡30分鐘。含酸的液體廢棄物，請先中和，再加入次氯酸鈉。

5、技術要點

1)加校準品與樣本時，每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉污染。

2)在應用自動洗板機時，加入洗液之后，設置30秒的浸泡程序，或者在不同的洗滌步驟將微孔板掉轉180度，這樣可以提高分析的準確度。

3)為保證結果的精確性，孵育時封好封板膜。

4)顯色底物在添加之前應是無色的。保持顯色底物始終處于避光態。

5)終止液的添加順序應與顯色底物的添加順序相同。

6)添加終止液之后，底物的顏色應由藍色轉變為黃色。如果底物呈現綠色，說明終止液與顯色底物沒有充分混勻。

7)在任何情況下，避免接觸微孔板的內表面。

8)實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封(低溫干燥)保存。

檢測準備與步驟

1、樣本采集與貯存

細胞培養上清

2000 × g條件下離心20m分鐘，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復凍融。

血清樣本

離心管收集血清。血樣凝集30分鐘后，2000 × g離心10分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存，避免反復凍融。

血漿樣本

EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝收集血漿樣本。2000 × g離心20分鐘收集樣本。即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存，避免反復凍融。

組織樣本

用預冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9 mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎或反復凍融。最后將勻漿液5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。

細胞提取液樣本

貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每1×10⁶個細胞中加入150-200μLPBS重懸并通過反復凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。

注意：

1)避免樣本的反復凍融，在檢測前，冷凍樣本應緩慢地恢復至室溫，輕柔混勻。

2)本試劑盒可能適用于其它生物學樣本，但是未充分驗證。

2、試劑準備

1)用前，所有的組分都要至少復溫30min，確保充分復溫到室溫。

2)濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結晶產生，這屬于正?，F象，水浴加熱使結晶完全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。

3、檢測步驟

1)試劑、樣本平衡：檢測之前請將所有的試劑、樣本平衡至室溫，標準品、質控品和樣品，建議做復孔。

配置工作液：按前面試劑準備中描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。

2)加標準品、樣本：設置標準品孔、樣本孔和空白孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL，樣本孔加待測樣本50μL，空白孔不加。

3)加HRP標記抗體：除空白孔外，標準品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100μL。

4)孵育：使用封板膜封板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60分鐘。

5)洗滌：棄掉液體，每孔加入300μL洗液洗板，靜置20s，洗滌5次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實驗性能，必須徹底移除殘留液體。

6)加底物顯色：每孔加入50μL顯色底物A、B各50μL，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15分鐘。

7)加終止液：每孔加入50μL終止液。顏色由藍色變為黃色。如果顏色呈現綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕叩擊板框，充分混勻。

8)檢測讀數：在15分鐘之內，使用450nm酶標儀進行檢測讀數。

4、廢物處理

所有使用或未使用的試劑，所有污染性的一次性材料，應當遵循傳染性或潛在傳染性產品的處理程序，每個實驗室都有責任根據其實驗的類型和危險性級別，進行廢物和污物的處理，同時要嚴格依照有關規定對待所有的廢物和污物。

分析

1、結果計算

1)復孔的值通常在20%的差異范圍內結果才有效，復孔平均值可作為測量值。

2)每個標準品或樣品的吸光度值應減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。

3)檢測完成后，以標準品濃度做為縱坐標，對應的吸光度(OD值)作為橫坐標，利用計算機軟件，采用多項式曲線擬合，創建標準曲線方程，通過樣本的吸光度(OD值)，利用方程計算樣品的濃度值。

4)如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數，才是樣品的最終濃度。

(示意圖，僅供參考)

2、試劑盒的性能

1)物理性能

試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣。

2)劑量反應曲線線性

標準品劑量反應曲線相關系數r值，大于等于0.99。

3)精密度

批內精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。批內變異系數CV%小于8%。

批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。批間變異系數CV%小于12%。

4)檢測范圍

62.5 pg/mL – 2000 pg/mL

5)靈敏度

最低可檢測濃度為10 pg/mL。

6)特異性

本試劑盒識別天然和重組小鼠骨骼肌肌鈣蛋白I(sTnI)。

7)穩定性

2℃-8℃保存，有效期6個月。

說明

由于現有條件及科學技術水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產品可能存在一定的質量技術風險。

1、最終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環境密切相關，請務必準備充足的標本備份。

2、不同批次的同一產品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據試劑盒內說明書進行實驗操作，網站電子版說明書僅作參考。

3、只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結果。

4、本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。

5、使用化學裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學物質的引入導致ELISA實驗結果偏差。

6、若樣本為細胞培養上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態、細胞數量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。

7、某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。